參與PCR反應(yīng)的五種主要物質(zhì)分別是哪些？

 　PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶DNA序列的的技術(shù)，通過(guò)多個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸，能夠使微量的遺傳物質(zhì)在幾小時(shí)內(nèi)得到幾百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

1．引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。

引物的選擇將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識(shí)別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。

（1）引物長(zhǎng)度

PCR特異性一般通過(guò)引物長(zhǎng)度和退火溫度來(lái)控制。引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18～27bp，但不應(yīng)大于38bp。引物過(guò)短時(shí)會(huì)造成Tm值過(guò)低，在酶反應(yīng)溫度時(shí)不能與模板很好的配對(duì)；引物過(guò)長(zhǎng)時(shí)又會(huì)造成Tm值過(guò)高，超過(guò)酶反應(yīng)的*適溫度，還會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，而且合成長(zhǎng)引物還會(huì)大大增加合成費(fèi)用。

（2）引物堿基構(gòu)成

引物的G+C含量以40～60%為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5～10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55～80℃，其Tm值*好接近72℃以使復(fù)性條件*佳。引物中四種堿基的分布*好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

（3）引物二級(jí)結(jié)構(gòu)

引物二級(jí)結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3’末端形成的二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3’端或近3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。

（4）引物3’端序列

引物3’末端和模板的堿基*配對(duì)對(duì)于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3’末端*后5到6個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯(cuò)配過(guò)多，通過(guò)降低反應(yīng)的退火溫度來(lái)補(bǔ)償這種錯(cuò)配不會(huì)有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。

引物3’末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)，尤其是在3’末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。這將會(huì)在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。

引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（**值不超過(guò)9），負(fù)值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。

需要注意的是，如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。

（5）引物的5′端

引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。對(duì)于引入一至兩個(gè)酶切位點(diǎn)，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計(jì)完畢后確定，便于后期的克隆實(shí)驗(yàn)，特別是在用于表達(dá)研究的目的基因的克隆工作中。

（6）引物的特異性

引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源，特別是與待擴(kuò)增的模板DNA之間要沒(méi)有明顯的相似序列。

2．酶及其濃度

Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶，是從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中分離的。Taq DNA聚合酶是一個(gè)單亞基，分子量為94 000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，無(wú)3’-->5’的外切核酸酶活力，會(huì)在3’末端不依賴模板加入1個(gè)脫氧核苷酸（通常為A，故PCR產(chǎn)物克隆中有與之匹配的T載體），在體外實(shí)驗(yàn)中，Taq DNA聚合酶的出錯(cuò)率為10-4～10-5。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

此酶具有以下特點(diǎn)：

（1）耐高溫，在70℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃下反應(yīng)2小時(shí)后為原來(lái)的40%。

（2）在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，故不必在擴(kuò)增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶。

（3）一般擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度可達(dá)2.0 kb，且特異性也較高。

PCR的廣泛應(yīng)用得益于此酶，目前各試劑公司中開(kāi)發(fā)了多種類(lèi)型的Taq酶，有用于長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶，擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá)40kb；有在常溫條件下即可應(yīng)用的常溫PCR聚合酶；還有針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象的酶等。

一典型的PCR反應(yīng)約需的酶量為2.5u（總反應(yīng)體積為50ml時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

3．dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200mmol/l，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

4．模板（靶基因）核酸

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑（酚與氯仿抽）抽提除去蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸，該核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。

模板DNA投入量對(duì)于細(xì)菌基因組DNA一般在1~10ng/l，實(shí)驗(yàn)中模板濃度常常需要優(yōu)化，一般可選擇幾個(gè)濃度梯度（濃度差以10倍為一個(gè)梯度）。在PCR反應(yīng)中，過(guò)高的模板投入量往往會(huì)導(dǎo)致PCR實(shí)驗(yàn)的失敗。

5．Mg2+濃度
Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200mmol/l時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液，而Mg2+也已添加，如果特殊實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用無(wú)Mg2+的緩沖液，，在PCR反應(yīng)體系中添加一定量的Mg2+。